Descrizione
Gli aptameri di RNA sono molecole a singolo filamento che mostrano affinità e selettività molto elevate verso diversi bersagli molecolari. Poiché l’estrema flessibilità dell’RNA ne ostacola la caratterizzazione con metodi sperimentale, il contributo computazionale nell’indagine strutturale di queste entità chimiche è in continua crescita ed ha prodotto risultati importanti. Noi stiamo sviluppando aptameri di RNA capaci di legare e controllare attività dell’enzima DNMT3a con un approccio combinato di metodi teorici e sperimentali. Le proteine della famiglia DNMT sono infatti responsabili di meccanismi epigenetici fondamentali nella regolazione dell’espressione genica e quindi rappresentano potenziali sistemi bersaglio per il controllo di diverse malattie. Per ridurre l’aberrante attività di DNMT3a correlata al dolore neuropatico (NP) il nostro progetto prevede di disegnare aptameri di RNA mediante progettazione razionale, guidata dai determinanti strutturali di ripiegamento dell’RNA e di riconoscimento della proteina bersaglio e di selezionare nuovi candidati da librerie massive di sequenze, con algoritmi in fase di sviluppo. Studi di risonanza magnetica nucleare (NMR) verranno condotti per confermare i risultati strutturali della modellazione teorica in corso. Verrà progettato e sintetizzato un sistema di trasporto appropriato per consentire il raggiungimento e il rilascio degli RNA nella cellula neuronale per colpire DNMT3a. Saggi biochimici su linee cellulari e modelli animali confermeranno la capacità dei candidati di inibire l’attività eccessiva di DNMT3a nell’NP e serviranno per l’ottimizzazione delle sequenze di RNA e il raffinamento dei modelli teorici.
La piattaforma proposta è pianificata per essere implementata ed estensa in futuro allo studio e alla progettazione di altre strategie terapeutiche basate sull’utilizzo di molecole di RNA.
Obiettivi e risultati attesi
Questo progetto rappresenta una dimostrazione di fattibilità della piattaforma computazionale/sperimentale ideata e servirà alla creazione di una solida strategia per la progettazione razionale di RNA terapeutici. Il progetto prevede sinergicamente il lavoro di tre gruppi di ricerca RU1 (IBB), RU2 ed RU3, descritti nei paragrafi successivi, che si occuperanno delle seguenti attività:
- RU1 | disegno razionale e screening di candidati aptameri. Metodiche usate presso l’istituto IBB: modellistica molecolare, predizione struttura tridimensionale di RNA, simulazioni di dinamica molecolare (MD) analisi degli stati conformazionali esplorati dalle molecole di RNA e dei relativi ripiegamenti. Simulazioni di MD del sito catalitico di DNMT3a (DNMT3aCD). Studi di interazione RNA-DNMT3aCD con metodi teorici e validazione sperimentale dei motivi strutturali di RNA predetti (NMR). Derivazione di punti di ancoraggio per la progettazione ex-novo di nuove molecole di RNA capaci di interagire con DNMT3aCD. Sviluppo di algoritmi di selezione di sequenze da librarie massive. Ottimizzazione e raffinamento delle sequenze degli RNA candidati sulla base de risultati sperimentali ottenuti dalle altre unità (RU2 ed RU3);
- RU2 | produzione di un sistema vettoriale specifico per il trasporto degli aptameri nelle cellule neuronali, tale da consentire il raggiungimento dell’enzima bersaglio (DNMT3a);
- RU3 | validazione sperimentale in vitro e in vivo dell’interazione tra i candidati aptameri e DNMT3a e dell’efficacia degli RNA nel controllare la funzionalità enzimatica, per il trattamento del dolore nell’NP.
Proponenti
- Istituto di Biostrutture e Bioimmagini-CNR
Enti coinvolti
- Università degli studi di Napoli “Federico II”
- Università degli studi della Campania “Luigi Vanvitelli”