Descrizione
Nell’omeostasi cutanea, si verificano interazioni dinamiche tra l’epidermide, il microbioma e le cellule immunitarie. La distruzione di questo equilibrio è alla base di molti disturbi cutanei (come la dermatite atopica, la psoriasi e i tumori). Questi eventi patologici possono essere causati da modifiche nella composizione delle comunità microbiche, danni fisici alla barriera epidermica, un processo di differenziazione anormale dei cheratinociti e una risposta immunitaria aberrante, autoprodotta e autosostenuta. Un ruolo cruciale nell’omeostasi epidermica è svolto da CARD14, una proteina multidominio adattatrice, che conferisce suscettibilità alla psoriasi. CARD14 è espressa specificamente nella pelle e forma un complesso di segnalazione con BCL10 e MALT1 (complesso CBM), che attiva NF-κB e regola l’equilibrio tra infiammazione e risposta immunitaria innata ai pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP). Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della regolazione da parte di CARD14 delle vie di segnalazione specifiche per la pelle sono ancora poco chiari. Pertanto, la proposta del progetto ha lo scopo di indagare il coinvolgimento di CARD14 e del complesso CBM in: (I) differenziazione dei cheratinociti, (II) risposta innata indotta dai TLR e (III) regolazione dello stato redox specifico dei cheratinociti e della perossidazione lipidica, con particolare attenzione agli eventi perturbatori che causano la psoriasi. Per chiarire le funzioni specifiche di CARD14 nell’epidermide, i nostri obiettivi secondari saranno:
- L’analisi strutturale delle interazioni che CARD14 e le sue varianti, sia naturali che patogene, stabiliscono con i trasduttori di segnale antivirali recentemente identificati come nuovi partner molecolari, TANK e MAVS;
- Lo studio funzionale del ruolo della ferroptosi, una nuova forma di morte cellulare regolata dipendente dal ferro, causata da un livello letale di ROS intracellulari, nella patogenesi della psoriasi.
Questi obiettivi saranno raggiunti attraverso un approccio multidisciplinare, grazie alle diverse competenze delle unità di ricerca in: biologia cellulare e molecolare, biochimica, metabolismo cellulare, dermatologia, immunità mucosale. Le attività proposte sono organizzate in pacchetti di lavoro che ciascuna unità di ricerca porterà avanti autonomamente, in base alle competenze specifiche. Il progetto contribuirà alla definizione di nuovi approcci terapeutici, attraverso l’identificazione di nuovi target e biomarcatori per il trattamento dei disturbi infiammatori della pelle.
Obiettivi e risultati attesi
Dati preliminari prodotti dalla BN-RU suggeriscono che CARD14sh potrebbe interagire e influenzare l’aggregazione della proteina MAVS contenente il dominio CARD. Esperimenti di Co-IP e test del doppio ibrido in lievito hanno anche dimostrato che CARD14sh interagisce con la proteina adattatrice immunomodulatoria TANK. In particolare, i mutanti CARD14shE138A e E142G rilevati nell’ambito dei processi patologici della psoriasi hanno mostrato una minore efficacia nel legare TANK rispetto a CARD14shWT. Pertanto, l’analisi in vitro delle eventuali interazioni dirette tra CARD14sh/MAVS e CARD14sh/TANK fornirà informazioni importanti riguardo le funzioni di CARD14sh. Inoltre, l’analisi dell’impatto delle mutazioni associate alla psoriasi, sia attivanti (E138A ed E142G) che non attivanti (R38C) NF-κB, sulle interazioni oggetto di studio potrebbero aiutare a chiarire i meccanismi molecolari alla base dei processi patologici in cui CARD14 è implicata. L’unità IBB si occuperà di esprimere CARD14sh e le sue isoforme a singola mutazione (E138A, E142G e R38C), le proteine MAVS e TANK in E. coli, purificare e caratterizzare biochimicamente queste proteine e di studiare la capacità di CARD14sh e dei suoi mutanti di interagire con le proteine MAVS e TANK. Inoltre, verranno effettuati studi cristallografici sugli eventuali complessi proteina-proteina ottenuti.
Nello specifico, le proteine oggetto di studio saranno prodotte in E. coli testando diverse condizioni di espressione. Le proteine saranno purificate mediante svariate tecniche cromatografiche. Il peso molecolare, lo stato oligomerico e la struttura secondaria saranno valutati mediante spettrometria di massa (MS), light scattering (LS) e dicroismo circolare (CD). Per i saggi di interazione, verranno impiegate tecniche di dosaggio immunoenzimatico (ELISA), calorimetria di titolazione isoterma (ITC), termoforesi su microscala (MST) e interferometria su biosensore a strato sottile (BLI). Le misurazioni ELISA e BLI consentiranno l’indagine dell’interazione proteina-proteina immobilizzando uno dei due partner di legame su una piastra o un biosensore, rispettivamente. Con MST, verranno rilevati i cambiamenti nella temperatura e nel movimento delle molecole fluorescenti lungo un gradiente termico microscopico in funzione della concentrazione di un ligando non marcato. Infine, ITC, una tecnica label-free, fornirà informazioni sui parametri termodinamici del legame proteina-proteina in soluzione. Tutti i metodi descritti permetteranno di stimare le costanti di affinità di legame, ottenendo così un’analisi quantitativa. Qualora vi fosse la formazione di complessi grazie all’interazione diretta delle proteine sopraccitate, verrà effettuata una caratterizzazione strutturale mediante cristallografia a raggi X. A tale scopo, verrà utilizzato un sistema automatico di cristallizzazione e la raccolta dati sarà effettuata sia tramite la sorgente ad anodo rotante disponibile presso l’IBB, sia tramite il sincrotrone. Infine, la struttura del complesso sarà risolta mediante il metodo di sostituzione molecolare.
Proponenti ed Enti coinvolti
- Università degli Studi del Sannio di Benevento
- Università degli Studi “Magna Graecia” di Catanzaro