Descrizione
Le malattie da prioni (PD) sono rari disturbi neurodegenerativi attualmente incurabili e che portano alla morte in tempi brevi. La PD più comune negli esseri umani è la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD), che colpisce circa 1 persona su un milione in tutto il mondo ogni anno. L’evento molecolare scatenante nella patogenesi delle PD è la conversione conformazionale della proteina prionica cellulare (PrPC) in un’isoforma misfolded e propensa all’aggregazione, nota come PrPSc, che forma fibrille che si accumulano nel cervello. PrPSc è un agente infettivo proteico, capace di propagare la propria conformazione anomala in maniera autocatalitica, utilizzando come substrato l’isoforma nativa di PrPC. La natura infettiva e la trasmissibilità delle PD rappresentano un rischio considerevole per la salute pubblica, sottolineando l’importanza della ricerca in questo campo. PrPC consiste in un dominio N-terminale (NTD) disordinato e in un dominio C-terminale globulare (CTD), organizzato in una conformazione α-elicoidale. La formazione di PrPSc è innescata da un drastico cambiamento strutturale della conformazione nativa del CTD, che si riorganizza generando isoforme misfolded. Recentemente, è stato dimostrato che il dominio NTD disordinato di PrPC stabilisce una serie di interazioni elettrostatiche con il dominio globulare CTD, essenziali per la stabilizzazione della conformazione nativa di PrPC. Questo accoppiamento inter-dominio tra NTD e CTD è emerso come un meccanismo molecolare cruciale nel modulare le dinamiche conformazionali a lungo raggio (µs-ms) che regolano il processo di ripiegamento di PrPC, contrastando le transizioni strutturali che portano al misfolding. Sulla base di questi risultati, l’obiettivo del progetto è sviluppare peptidi e peptidomimetici capaci di stabilizzare la conformazione fisiologica nativa di PrPC riproducendo la superficie di interazione che l’NTD stabilisce con il CTD. Tali molecole potrebbero contrastare l’evento di misfolding fatale che innesca il processo di aggregazione dei prioni.
Obiettivi e risultati attesi
I principali obiettivi del progetto sono:
- task (1) identificare, attraverso studi strutturali via NMR, i residui aminoacidici chiave che mediano l’interazione tra NTD e CTD di PrPC;
- task (2) sviluppare una serie di peptidi/peptidomimetici mimetici dell’NTD che riproducano l’interfaccia di interazione con il CTD;
- task (3) determinare se, e in che modo, i peptidi/peptidomimetici derivati dall’NTD possano modulare le dinamiche di folding del CTD per prevenire il misfolding e l’aggregazione del PrPC.
L’Unità IBB collaborerà all’implementazione di tutti gli obiettivi principali del progetto. In particolare, l’Unità IBB contribuirà alla realizzazione della task (1) sviluppando un protocollo efficiente di espressione e purificazione per la preparazione dei domini di PrPC in forma ricombinante, comprese le varianti arricchite con isotopi stabili (15N e/o 13C), che saranno utilizzate negli esperimenti NMR finalizzati a identificare i residui chiave coinvolti nell’accoppiamento interdominio. Inoltre, adoperando la metodologia dell’expressed protein ligation (EPL), l’Unità IBB preparerà la proteina PrPC full-length contenente l’NTD nella forma arricchita con 15N/13C. Questo approccio, noto come segmental isotope labeling, permetterà di affinare l’analisi strutturale tramite NMR delle dinamiche molecolari dell’NTD nel contesto della proteina nativa intera.
Sulla base dei dati ottenuti nella task (1), l’Unità IBB si occuperà della progettazione e sintesi di una collezione di peptidi/peptidomimetici che mimano l’NTD e replicano la superficie di interazione che stabilisce con il CTD (task (2)). L’Unità IBB collaborerà anche allo screening della collezione di peptidi/peptidomimetici sviluppati, al fine di valutare la loro capacità di legare il CTD e prevenirne il misfolding e l’aggregazione. Studi di interazione in vitro saranno condotti utilizzando una serie di tecniche, tra cui NMR, Isothermal titration calorimetry (ITC) e Bio-Layer Interferometry (BLI). Studi di dicroismo circolare (CD) e spettroscopia di fluorescenza con thioflavin T saranno impiegati per selezionare i peptidi/peptidomimetici capaci di prevenire il misfolding e l’aggregazione di PrPC (task 3). Complessivamente, questo progetto si propone di definire una nuova strategia per lo sviluppo di potenziali candidati farmaci in grado di inibire la formazione dell’isoforma misfolded del PrPC e la sua aggregazione patologica.
Proponenti
- Dipartimento di Scienze e Tecnologie Ambientali, Biologiche e Farmaceutiche (DiSTABiF) dell’Università degli studi della Campania Luigi Vanvitelli
Enti coinvolti
Istituto di Biostrutture e Bioimmagini – CNR